神經幹細胞治療小兒腦癱的研究進展 關鍵詞：神經幹細胞 neural stem cell 小兒腦癱 cerebral palsy
小兒腦癱，是以慢性、非進行性運動功能障礙爲特徵的一組症候羣，患兒常伴有不同程度的認知障礙。腦癱的發生多與產傷、早產兒缺血缺氧、出生後感染和中毒等因素有關。隨着早產兒存活率的升高，腦癱的發病率也上升至人口總數的0.06%-0.59%。我國此類患兒不少於250萬，且每年新增患者約20萬左右。目前尚未找到一種直接針對腦癱患兒腦損傷病理基礎的治療方法，因此多數治療效果欠佳。而神經幹細胞治療具有潛在的功效，在其它神經系統疾病(如中風等)中的應用已取得較好的效果，所以人們開始對幹細胞移植治療腦癱進行了各種實驗研究。從現有的動物實驗數據看，神經幹細胞治療小兒腦癱是一項頗有前景的治療方法。現將部分研究結果綜述如下。
1 小兒腦癱的病理基礎
許多腦癱患兒由於灰、白質都缺少，因此需要採用有全腦細胞成分的幹細胞。被移植的細胞要有顯著的可塑性及適合相應部位定向發展的潛能。
缺血缺氧性損傷是腦癱的特徵性損害，它以廣泛的神經組織缺失爲特徵。缺血缺氧損傷的早產兒其損傷在大腦白質內，主要表現爲腦室旁大腦白質容積減少，稱爲腦室旁腦白質軟化症（periventricular leukomalacia，PVL）。腦室周圍主要的細胞類型是少突膠質前體細胞，它對缺血缺氧損傷最爲敏感，在懷孕30-36周時最易損傷而導致PVL。缺血缺氧損傷可耗竭圍產期大鼠腦室下層(subventricular zone，SVZ)的少突膠質前體細胞和神經幹細胞。此種變化在損傷後很快就會發生，並對少突膠質前體細胞以後的發育產生不良影響。少突膠質細胞分佈在神經元胞體附近和神經纖維周圍，其突起末端擴展成扁平薄膜，包繞神經元的軸突形成髓鞘，它是中樞神經系統的髓鞘形成細胞，其發育障礙直接導致白質的發育障礙。少突膠質前體細胞在小兒腦癱是重要的，是否在不替代軸突的情況下，僅僅替代軸突髓鞘的絕緣性就能改善功能，這一點還需要進一步證實。
2 移植的細胞類型
用來移植的細胞類型、來源、發育階段是神經幹細胞移植研究和討論的主要內容，而用於臨牀試驗的理想細胞應具有以下特徵：容易獲得，不涉及倫理問題，有足夠的增殖潛能，沒有感染、腫瘤轉移的危險，並能改善臨牀症狀。如果用自體細胞進行移植，還可免除排斥反應的影響。總的來看，臨牀上可供移植的細胞類型有：成人或胚胎的神經幹細胞、永生神經前體細胞 (如NT2-N 細胞)、原始骨髓組織、骨髓間質細胞、外周血單核細胞、臍帶血細胞、臍帶基質細胞等。
2.1神經幹細胞和永生細胞系神經幹細胞可在腦內特定部位進行增殖、遷移、分化，而不同的培養方式可對移植後細胞的行爲產生顯著的差異。胚胎神經幹細胞在剛植入時增殖能力極強，但經過培養後再植入成年小鼠的腦室下層和紋狀體後，增殖和分化能力明顯降低。神經幹細胞在成熟的腦組織中，多分佈於腦室旁、室管膜下區或者海馬區域，在實驗室中所表現的特性與胚胎神經幹細胞相似。細胞所具有的增殖和分化特性在腦內不同部位是不同的。
NT2細胞是從畸胎癌患者提取出的神經元祖細胞中得到的，這些神經元祖細胞經過類維生素A（retinoic acid）處理後，分化爲神經元細胞。Ferrari等［1］證實把未分化的NT2細胞移植到未受傷的小鼠腦內，NT2可遷移一定的距離並分化爲神經元和少突膠質細胞，而將NT2細胞植入受傷的有免疫活性的小鼠大腦皮層後，細胞在海馬齒狀回的顆粒下層和側腦室壁的腦室下層增殖擴散，併產生具有功能的錐體神經元。
2.2 原始的骨髓組織、骨髓基質細胞和其它血細胞骨髓中的非造血細胞包括能分化形成間葉細胞、神經元和膠質細胞的骨髓基質幹細胞(marrow mesenchymal stem cells, MSCs)。原始的骨髓組織經過培養能產生神經祖細胞。在對接受原始骨髓組織移植患者的屍檢中，研究人員發現受體腦組織中的一部分神經元就來源於移植的原始的骨髓組織。將MSCs經腦室、腹腔、紋狀體或直接腦局部移植後，同期給予腦源性神經營養因子，在腦內可檢測到骨髓源性的神經元細胞。MSCs在大鼠脫髓鞘的脊髓中可形成髓鞘，在大腦中動脈阻塞的大鼠中可產生內皮細胞和神經元，這表明MSCs是具有多潛能的成體祖細胞，可分化成具有中胚層、內胚層和神經胚層的細胞。
從人的外周血的單核細胞中也可提取出多能幹細胞，它們在一定條件下能分化爲神經元細胞。臍帶血和臍帶血基質細胞可作爲神經元細胞的來源，可分化成多種神經細胞，包括神經元、少突膠質細胞、星形膠質細胞。給大腦中動脈阻塞的動物模型靜脈注入臍帶血，可見2%的細胞表達了神經元標誌物，2周後動物的行爲表現明顯改善。臍帶血基質細胞和臍帶血細胞對於小兒腦癱患者而言都有自體同源的優點，很有希望成爲今後研究的細胞來源。此外在移植的細胞不能太純，應混有施旺細胞，它可支持神經幹細胞的生長，並有誘導其分化的作用［2］。
對幹細胞的分化、增殖調控機制的瞭解對幹細胞移植是關鍵的，但人們對其瞭解得並不多。FGF2 在調節幹細胞分化和嗅球神經形成上有重要作用［3］。Olig1基因的短暫表達可促進神經幹細胞向少突膠質前體細胞的分化［4］。而在神經幹細胞向損傷部位的遷移過程中，間質細胞來源的1alpha/CXC可發揮趨向作用［5］。過度表達的Bcl-2基因，也可使患鼠腦皮質處的幹細胞存活增加、分化加強，功能也較非基因修飾的對照組明顯改善［6］。
但哪一種細胞更適宜移植治療小兒腦癱呢？哪一分化階段的細胞最適於移植呢？分化早期的細胞比分化相對成熟的細胞更有優勢嗎？經過培養分化成具有一定定向能力後再行移植會更好嗎？目前這些均不清楚，如果要在臨牀應用中取得最好的效果，那麼這些問題都需進一步的研究，並得到明確的回答。
3 移植的方法與時機
如果採用直接移植到腦內，那麼應在接近損傷部位選擇穿刺點。在一個大腦中動脈阻塞的腦缺血模型中移植MHP36細胞(來自轉基因小鼠的上皮細胞)後，發現不同移植位置有不同的效果。腦實質內注射可減少雙側不對稱性，但對空間學習能力無明顯提高，相對應的是經腦室內移植的動物其空間學習能力明顯提高，而雙側不對稱性無改善。而移植入紋狀體的細胞可越過中線，進入對側同樣的部位，並分化成與對應位置一致的細胞亞型。在中風後，病變側半球可吸引移植的幹細胞，這提示修復利用了局竈性的修復機制，另一方面是將對側的神經通路的功能強化擴展［7］。腦室內與腦實質內移植的不同效果提示二者有不同的機制，需要進一步研究。
近來有人將神經幹細胞種植在一種多聚體骨架上，再將其直接移植入缺血缺氧性損傷鼠的腦梗塞區。此法可促進宿主與NSCs的相互作用，利於神經生長的精細進行，結果顯示實質損失顯著地減少，包括宿主與供者來源的神經元構成的多樹狀的複雜神經網絡出現，同時也形成了一些解剖聯繫，但移植後的行爲功能的改善狀況沒有報道。這些生物橋通過促進一系列相應的NSCs與宿主間的相互作用來促進功能的重塑，包括促進神經元的分化、強化神經處理的細節、促進皮質組織的再形成、促進胞間通訊、減少炎症與瘢痕形成、促進神經組織的修復［8］。
另外移植方法是將細胞懸液注入脈管系統或是直接注入椎管蛛網膜下腔。Jeong等［9］在顱內出血的大鼠模型中，經靜脈移植幹細胞後檢測其分化的細胞中10%爲神經元75%爲星形膠質細胞。2周後經轉杆試驗測試，幹細胞移植組功能改善明顯。作者認爲經靜脈移植後的神經幹細胞可以進入顱內出血的大鼠腦內，並在腦內存活、遷移、分化從而促進其功能恢復。另一項實驗對大腦中動脈阻塞大鼠傷後1、7、14天分別經靜脈移植入MSCs，結果表明1天后MSCs就在腦內生成神經元和星形膠質細胞和神經元，在1、7天時接受移植動物的軀體感覺恢復明顯，神經系統的評分升高，而在大腦內僅出現少量的MSC來源的神經元，這說明接受移植後所表現出的改善不僅與移植入的細胞本身有關，而且可能與神經營養因子有關，這說明經靜脈途徑移植同樣有效［10 11］。
傷後移植時間的問題較少受到關注，因爲大多數動物實驗都是在傷後即刻進行的，本問題就不存在或不重要。但在臨牀上對病人的處理，在時間上則有一定的滯後性的。那麼具體是在傷後多久行移植手術有意義或處於最佳的手術時機呢？一般而言，移植的時間當然應是在傷後越短的時間內進行效果越佳，在傷後一定間期內進行移植是有效的，有文獻報導移植間期長短與移植成功的細胞數目呈反比，但具體時機尚無精確數據。
4 移植後的功能重建
目前有大量實驗表明植入細胞可以成活，並分化成特定的神經細胞，但這些植入的細胞是否與原存的細胞整合，併爲實現一定的功能而形成有機的聯繫呢？通過顯微鏡和免疫組織化學的方法對移植後的標本進行觀察，形態學上的證據是植入的細胞和腦組織可融爲一體。植入的NSCs可整合入宿主的神經環路，併發育爲有功能的錐體細胞，其可產生潛在活力、能接收鄰近細胞興奮或是抑制信息的細胞。
Toda等［12］在成熟大鼠海馬區分化來源的神經幹細胞中加入FGF後幹細胞可較早地產生神經元和神經膠質細胞。利用免疫熒光技術觀察到某些大鼠海馬區分化來源的神經幹細胞對微管相關蛋白2ab、神經絲 200和突觸小泡蛋白具有免疫反應性。這些細胞已具有了功能神經元的一些特性，比如：動作電位、突觸後的微電流等。作者認爲，成熟幹細胞分化來源的神經元能表達非NMDA穀氨酸受體和GABA受體，並可形成功能性的突觸，實驗結果證實神經元已整合入神經環路。
更多的結果在於直接觀察到功能的改善。無論選擇何種方法，不論是細胞的直接作用還是經體液因子的輔助作用，功能是否得到改善是評價其好壞的主要標準。來源於小鼠的多能祖細胞系的NSCs可在損傷的腦組織中存活，分化爲神經系統的成分，改進運動功能障礙的症狀。在實驗中對單側腦皮質損傷的C57BL/6小鼠3天后通過立體定向方法將NSCs移植至腦皮質損傷區，在13周後在鄰近損傷的海馬與皮層區域可檢測到移植神經幹細胞的存活，它們可表達神經元標誌NeuN或膠質細胞標誌物GFAP，通過轉杆試驗檢測，結果表明移植後小鼠的運動功能較未移植小鼠明顯改善［13］。
在一個大鼠短暫全腦缺血模型中，大鼠大腦海馬CA1區域的錐體神經元細胞數量減少約90-95%，直接在此處定向移植入海馬來源的NSCs後，14天后在損傷部位只有1%-3%的植入細胞成活，其中3%-9%表達神經系統的標誌物NeuN。通過水迷宮試驗證實多於120個神經元標誌物陽性細胞的大鼠在空間學習能力方面有改善［14］。大腦中動脈阻塞1個月的動物在大腦內移植NT2細胞，同時應用環孢菌素，其功能有明顯改善。對CA1區缺血性損傷的大鼠，向其受傷側的大腦半球植入海馬乾細胞系MHP36細胞後，通過尼氏染色表明移植物在CA1區可形成錐體樣細胞並長入側腦室，MHP36細胞可表現出神經元與膠質細胞的形態, 在CA1區均有分佈，同時其感覺、運動功能得到恢復，但其空間學習能力和記憶力沒能恢復。這表明神經幹細胞能適應移植的部位並分化成成熟的神經元與膠質細胞，在以後的研究中，作者認爲移植於損傷的對側也能產生作用，這表明移植具有遠距離效應，細胞能遷移到對側受損區域［15］。
Zhao 等報導應用自體幹細胞移植治療開放性顱腦損傷的臨牀一、二期病人，用超順磁性微粒體作NSCs標記物，結果顯示幹細胞在腦內有較好的生長活性，並能明顯改善病人的預後［16］。
5 移植的安全性
安全性問題包括：移植細胞造成感染、注入細胞所引起的炎症和排斥反應的危險等。如應用於臨牀，這些問題都需要進一步澄清。Farci等［17］對進行造血幹細胞移植治療的患者進行隨訪分析，發現部分病人出現嚴重的神經系統的併發症，272例因不同的疾病而接受移植的患兒有2例出現免疫性疾病。最嚴重的風險出現在同種異體移植上，而行同種自體移植時出現神經系統併發症的概率就大大降低。大量報道認爲此種方法是安全可行的［18］。細胞移植應用於臨牀需要具備以下的條件：固定的場所和團隊、術前仔細檢查病人並針對不同的病人制定特定的治療方案、選擇恰當的細胞類型和恰當的移植時機、方法，從而保證移植的安全和治療的質量。
6 小結
通過動物實驗證實，用幹細胞治療腦癱和腦損傷可明顯改善功能。但其作用機制尚未明瞭，其長期的安全性和有效性也不清楚，在人體也沒有嚴格對照實驗數據。幹細胞應用於臨牀將影響到醫學的每個領域，並對腦癱等許多疾病的治療帶來希望。然而此項技術應用於兒童之前，還有大量工作要做，比如在移植細胞的功能整合中細胞因子、生長因子、信號蛋白的作用，還有病人的個體化治療，在最後的階段應用靈長類動物模型進行實驗也是必需的。總之，動物實驗的數據強有力地證實將幹細胞治療應用於腦癱臨牀是大有裨益的，我們相信在不遠的將來應用幹細胞治療腦癱就將成爲現實。但目前還是以中醫傳統康復爲主要治療手段。
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