【摘要】 目的 瞭解舒林酸是否通過過氧化物酶增殖物激活受體γ（PPARγ）途徑影響人胃癌SGC- 7901細胞的增殖，初步探討PPARγ途徑在舒林酸抗腫瘤作用中的機制。方法 培養人胃癌SGC-7901 細胞，經特異的PPARγ抑制劑GW9662作用，採用四甲基偶氮唑藍比色法（MTT法）檢測舒林酸對細胞增殖的影響及用免疫細胞化學法檢測
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PPARγ、Bcl-2、Bax蛋白表達。結果 MTT法顯示GW9662作用後，舒林酸對SGC-7901細胞增殖的抑制作用減弱，細胞增殖增多，而且這種作用在一定範圍內呈劑量和濃度依賴性；免疫細胞化學法顯示GW9662預先干預與舒林酸單獨作用相比，SGC7901細胞的PPAR-γ蛋白表達明顯減少， Bax的表達亦明顯降低，而Bcl-2蛋白表達增強(P<0.01) 。結論 PPARγ途徑在舒林酸抗腫瘤作用中具有一定作用，其機制與激活PPARγ對Bcl-2、Bax蛋白的表達有關。
【關鍵詞】 舒林酸；人胃癌SGC- 7901細胞；PPARγ通路；GW9662； Bcl-2；Bax
A study of the effects of PPARγ pathway on the proliferation inhibition ofgastric cancer cells by sulindac and the underlying mechanism
WU Kejian, FEI Sujuan, LIU Junquan, CHEN Fuxing
1.Department of Gastroenterology, The Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu 221002, China;
2. Department of Central Laboratory, The 97th Hospital of PLA， Xuzhou, Jiangsu 221004, China
Abstract： Objective To investigate the effect of sulindac on the proliferation of human gastric cancer cell line SGC-7901 and its antineoplastic mechanism via the PPARγ pathway, so as to make a preliminary probe into the mechanism of the PPARγ pathway in the antineoplastic effect of sulindac. Methods Cultured human gastric cancer cell line SGC-7901 was treated by the specific PPARγ inhibitor GW9662, followed by detection of the effect of sulindac on the proliferation of SGC7901 cells by MTT assay and determination of the expressions of PPARγ, Bcl-2 and Bax protein by immunocytochemical method, respectively. Results MTT assay showed that the inhibitory effect of sulindac on human gastric cancer SGC7901 cells was attenuated subsequent to GW9662 treatment, with an increase in cell proliferation and in a dose-concentration dependence manner within a certain range. Meanwhile, the immunocytochemical result showed that with GW9662 pre-intervention in sulindac, compared with sulindac administration alone, the expression of PPAR-γ protein was obviously reduced, so was the Bax expression, while the expression of Bcl-2 was enhanced (P<0.01). Conclusion PPARγ pathway has certain role to play in the anti-tumor effect of sulindac, and the underlying mechanism is involved in the activation of PPARγ, the up-regulation of Bcl-2 expression and down-regulation of Bax protein expression.
Key words: sulindac; human gastric tumor SGC-7901; PPARγ pathway; GW9662; Bcl-2; Bax
既往認爲非甾體類抗炎藥（NSAIDs）發揮抗腫瘤作用主要是通過抑制環氧合酶-2（COX-2）的活性以拮抗腫瘤細胞增殖，但越來越多的新證據提示這並非是其惟一的抗腫瘤機制，亦可能通過COX-2非依賴途徑，如過氧化物酶增殖物激活受體γ（PPARγ）途徑誘導細胞凋亡而實現抗腫瘤效應［1-2］。目前在臨牀上，使用非選擇性非甾體類抗炎藥舒林酸（sulindac）預防結腸多發腺瘤的癌變，並證實PPARγ通道抑制劑GW9662能夠特異性地結合於PPARγ受體285位的半胱氨酸，從而翻轉NSAIDs藥物拮抗腫瘤細胞增殖的作用［3］。本研究通過觀察舒林酸對人胃癌細胞增殖和Bcl-2、Bax蛋白表達的影響，採用PPARγ通路特異性的抑制劑GW9662干預舒林酸對人胃癌細胞的增殖作用，探討PPARγ通路的特異性激活是否介導了舒林酸抑制胃癌細胞的增殖，旨在進一步明確NSAIDs抗癌作用的機制。
1 材料和方法
1.1 實驗材料和藥品
人胃癌細胞系SGC-7901購自上海細胞生物研究所。RPMI-1640培養液、小牛血清、胰蛋白酶購自Gibco公司；GW9662購自Cayman公司；舒林酸、四甲基偶氮唑藍（MTT）、二甲基亞碸（DMSO）購自Sigma公司；PPARγ、Bcl-2、Bax免疫細胞化學一抗、SP試劑盒均購自北京中山生物工程公司。
1.2 實驗方法
1.2.1 細胞培養
胃癌細胞株SGC-7901用含10％小牛血清、雙抗（青黴素1×105 U/L及鏈黴素1×105 U/L）的RPMI-1640培養液，以1×108/L的細胞密度接種入25 ml的細胞培養瓶中，置於37℃、5％CO2培養箱內培養。GW9662用RPMI-1640培養液配製，均爲現用現配。將舒林酸溶解於DMSO中，用RPMI-1640培養液將其配成濃度1.2 mmol/L的原液存於-20℃冰箱內，按照實驗要求用RPMI-1640培養基於磁力攪拌器中稀釋溶解。
1.2.2 MTT法
取對數生長期SGC-7901細胞配成1×108/L，接種於96孔板中，每孔0.6 ml，於37℃、5％ CO2培養箱內培養，24 h後加入GW9662（終濃度爲0.1、0.5、1、5 μmol/L），0.5 h後再分別加入舒林酸（終濃度爲0.6 mmol/L）。設陰性對照組和不加GW9662的舒林酸對照組。每個時間每個濃度重複6孔繼續培養，於24、48、72 h每孔加入MTT液20 μl，37℃孵育4 h後棄上清，每孔加入DMSO 150 μl，輕輕震盪使充分溶解，在540 nm 波長酶標儀上測定各孔光密度值（D值），求其平均值，同時計算細胞增殖率。
1.2.3 免疫細胞化學法檢測PPARγ、Bcl-2、Bax蛋白表達
待細胞生長融合度達到80%左右，除去培養液，4%多聚甲醛固定細胞15 min，Triton破膜10 min，滴加過氧化酶阻斷液室溫下孵育10 min以阻斷內源性過氧化物酶的活性，滴加正常非免疫動物血清，室溫下孵育10 min，滴加相應一抗室溫下孵育60 min，分別滴加二抗和鏈黴素抗生物素-過氧化物酶溶液，DAB顯色顯微鏡下觀察，自來水沖洗，蘇木素復染，鹽酸分化，溫水沖洗返藍，梯度乙醇脫水，乾燥後中性樹膠封片，同時設置PBS代替一抗作爲陰性對照。結果判定：PPARγ蛋白、Bcl-2、Bax 均以細胞核染色爲棕黃色或深棕黃色爲陽性細胞。PPARγ蛋白以單純細胞質着色而胞核無着色，或細胞核、細胞質均無着色爲陰性。Bcl-2、Bax 均以單純細胞核着色而胞質無着色，或細胞核、細胞質均無着色爲陰性。高倍鏡下選取10個視野，計數1000個細胞中的陽性細胞數（即陽性細胞佔計數細胞的百分比）。
1.3 統計學處理
實驗數據採用SPSS 11.0軟件進行統計學分析，所得結果均以均數±標準差表示，檢驗水準：α=0.05。
2 結 果
2.1 GW9662對人胃癌SGC-7901細胞增殖的影響
見表1。GW9662的工作濃度呈0.1、0.5、1、5 μmol/L遞增時，作用於不同時間的人胃癌SGC-7901細胞，結果示當GW9662濃度爲0.5 μmol/L 且作用時間在24 h時，其對人胃癌SGC-7901細胞增殖抑制的反轉作用達最大值，可以得出其最佳濃度爲0.5 μmol/L，有效作用時間爲24 h。表1 不同濃度的GW9662在不同時間對人胃癌SGC-7901細胞增殖的影響（略）
2.2 GW9662對舒林酸抑制人胃癌SGC-7901細胞增殖作用的影響
MTT測定結果如表2所示。舒林酸對SGC-7901細胞增殖有抑制作用，在各個時間點與陰性對照組相比均具有顯著性差異（P<0.01），且其作用具有時間依賴性。經PPARγ通路抑制劑GW9662作用後，舒林酸對人胃癌SGC-7901細胞增殖的抑制作用減弱，細胞的增殖反而較單用舒林酸組增多，具有顯著性差異（P<0.01），而且GW9662這種作用在一定範圍內呈劑量和濃度依賴性；同時亦可以從表1中看出，當GW9662濃度爲0.5 μmol/L時，這種翻轉舒林酸拮抗腫瘤細胞增殖的作用在24 h時達到高峯，而到48 h其拮抗作用反而下降。表2 不同濃度 GW9662干擾舒林酸對人胃癌SGC-7901細胞增殖作用的影響（略）
2.3 GW9662干預後舒林酸對人胃癌細胞PPARγ、Bcl-2、Bax表達的影響
見表3。表3 GW9662干預後舒林酸對SGC-7901細胞PPARγ、Bcl-2、Bax表達的影響（略）
由表3可見，GW9662干預後，SGC-7901細胞PPARγ的表達較單用舒林酸組明顯減少（P<0.01）。聯合用藥組SGC-7901細胞Bax蛋白表達較未用GW9662組下降，而Bcl-2相應上調，差異有統計學意義（P<0.01）。
3 討 論
腫瘤的發生、發展是由於多重突變使細胞的有絲分裂機制激活和凋亡機制失活所致。PPARγ是核激素受體超家族中的一員，發現它在多種腫瘤細胞中表達［4］。目前研究認爲，其主要能誘導細胞分化，而細胞的終末分化往往可使細胞停止生長，同時它還可以誘導腫瘤細胞凋亡，PPARγ結合配體可以通過凋亡抑制腫瘤的生長，並已經在許多腫瘤細胞株中得到證實［5-6］。至於其作用機制，研究顯示PPARγ被激活後可以通過誘導和上調Bcl-2家族蛋白髮揮抑制凋亡作用。Bcl-2和Bax同屬於Bcl-2蛋白家族，分別具有抑制和促進細胞凋亡功能，在細胞凋亡的調控中發揮重要的調節作用。Bax爲Bcl-2相關蛋白，可與抗凋亡蛋白Bcl-2形成異源二聚體，具有抑制Bcl-2而促進細胞凋亡的作用，是細胞凋亡的重要調控基因，Bcl-2與Bax的比值將影響細胞的凋亡。
GW9662是一種有效的、特異性的PPARγ抑制劑，本實驗採用遞增工作濃度的GW9662作用於人胃癌SGC-7901細胞且作用不同時間，發現當GW9662濃度爲0.5 μmol/L 且作用時間在24 h時，其對人胃癌SGC-7901細胞增殖抑制的翻轉作用達最大值，可以得出其最佳濃度爲0.5 μmol/L，有效作用時間爲24 h，因此本實驗在進行免疫細胞化學法檢測時採用的GW9662濃度爲0.5 μmol/L。
本實驗MTT法結果顯示，GW9662濃度在0.5 μmol/L以內、在24 h以內隨劑量的逐漸增加和作用時間的延長，其抑制舒林酸抗SGC-7901細胞生長的作用逐漸增強。達到0.5 μmol/L時，PPARγ受體已基本被全部結合，拮抗作用達到頂峯；超過0.5 μmol/L後，作用不再增強，反而由於GW9662本身對細胞的毒性，而使細胞增殖抑制率增加。超過24 h後GW9662逐漸失活，對舒林酸的拮抗作用亦逐漸減弱，細胞毒性作用也慢慢消失。Seargent等［7］亦發現超過飽和劑量的GW9662不但不會促進細胞增殖，反而會出現細胞毒性，導致細胞增殖受到抑制，主要認爲有兩種可能機制：①阻斷了細胞上的PPARγ受體，細胞不能繼續生長；②激活了非PPARγ通路所致，且認爲以後者可能性更大。另有報道認爲PPARγ激動劑曲格列酮對胃癌細胞亦有抗增殖效應［8］。而本實驗結果顯示，PPARγ特異性抑制劑GW9662可拮抗NSAIDs的促胃癌細胞凋亡的一部分作用，從而從側面說明PPARγ通路很可能是NSAIDs發揮抗腫瘤作用的一條重要通路。
同時本實驗對Bcl-2、Bax進行了免疫組化檢測，結果提示GW9662+NSAIDs與單用NSAIDs相比，Bcl-2有所上調，Bax有所下調，說明舒林酸的Bcl-2表達下調及Bax表達上調作用可被GW9662部分阻遏。結合在陰性對照組、GW9662組中Bcl-2高表達、Bax低表達的情況，我們推斷PPARγ通路參與了NSAIDs誘導胃癌細胞凋亡的機制。
綜上所述，GW9662可以部分阻礙舒林酸抑制SGC-7901細胞增殖的作用，抑制其凋亡，其機制可能與啓動細胞週期進程有關。GW9662是特異性PPARγ抑制劑，從側面證明了NSAIDs抗腫瘤機制中的COX-2非依賴途徑很可能包含PPARγ通路，爲NSAIDs的臨牀應用提供更加詳盡的理論依據。
【參考文獻】
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