阿司匹林對胃癌細胞株SGC7901增殖及核因子κB表達的影響

時間: 2012-08-23

【摘要】  目的: 探討阿司匹林對胃癌細胞SGC7901增殖及核因子κB p65(NFκB p65)表達的影響。方

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法: 培養胃癌細胞株SGC7901,採用MTT法檢測阿司匹林在不同濃度和不同作用時間下對胃癌細胞增殖的影響;DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測細胞凋亡;蛋白質印跡法和免疫熒光法檢測阿司匹林對胃癌細胞 NFκB p65表達的影響。結果: MTT結果顯示,在0.1~10 mmol/L濃度區間內,隨濃度增加和時間的延長,阿司匹林對SGC7901細胞的抑制率逐漸增加。SGC7901細胞經10 mmol/L阿司匹林作用6 h和12 h後,細胞發生凋亡。隨着阿司匹林作用濃度增加和作用時間延長,胃癌細胞 NFκB p65的表達逐漸降低。結論: 阿司匹林對胃癌細胞SGC7901的增殖具有抑制作用,且與阿司匹林的濃度和作用時間呈正相關,其作用機制可能與通過抑制胃癌細胞NFκB p65的表達而使細胞發生凋亡有關。

【關鍵詞】  胃癌細胞; 阿司匹林; 核因子κB; 細胞凋亡

Effect of aspirin on proliferation and nuclear factor kappa B p65

    expression in gastric cancer cell line SGC7901

    YAO Hongbo,  LI Yongjin,  TAO Yan,  HUANG Xiaojia, CHEN Yongchang

    (School of Medical Science and Laboratory Medicine,  Jiangsu University,  Zhenjiang Jiangsu  212013,  China)

    [Abstract]  Objective: To investigate the effect of aspirin on proliferation and nuclear factor kappa B expression in gastric cancer cell line SGC7901. Methods: Gastric cancer cell line SGC7901 was treated with aspirin of different concentrations or different time, effect of aspirin on proliferation and apoptosis in SGC7901 was evaluated by MTT assay and DNA agarose gel electrophoresis; expression of nuclear factor kappa B p65 was determined by Western blotting and immumofluorescence method. Results: Aspirin can inhibit the proliferation of SGC7901 among concentrations of 0.1~10 mmol/L. As the dose and time increased, the inhibitory of aspirin on proliferation of SGC7901 was significantly increased. Apoptosis was detected by DNA agarose gel electrophoresis after treating with aspirin of 10 mmol/L for 6 or 12 hours. Aspirin reduced expression of NFκB p65 in a concentration and time dependent pattern.  Conclusion: Aspirin inhibited proliferation of gastric cancer cell line SGC7901; the  inhibition of NFκB p65 expression inducing cellular apoptosis may ascribed to mechanism of antiproliferation activity of aspirin.

    [Key words]  gastric cancer cell;  aspirin;  NFκB p65;  apoptosis

    近年來研究表明,阿司匹林對胃腸道腫瘤具有預防作用[1],能抑制腫瘤細胞增殖,誘導腫瘤細胞凋亡,其作用機制包括多個方面但並不很明確。過去大量研究顯示,阿司匹林通過抑制環加氧酶2(COX2)活性,下調COX2的表達而發揮抗腫瘤效應[2]。但目前很多研究提示,阿司匹林能通過非COX2依賴性途徑發揮抗腫瘤作用。核因子κB(NFκB)信號通路便是其中之一。NFκB是細胞中的重要轉錄因子,在受到各種激活因子如腫瘤壞死因子(TNF)刺激時,NFκB與抑制分子IκB解離而被活化,p50p65二聚體進入細胞核發揮基因調控作用[3,4]。本實驗通過MTT法, DNA的瓊脂糖凝膠電泳以及蛋白質印跡法,研究阿司匹林對胃癌細胞SGC7901增殖的抑制作用和對NFκB p65表達的影響,初步探討其抑瘤機制。

    1  材料和方法

    1.1  材  料

    人胃癌細胞株SGC7901由中科院上海細胞生物研究所提供。小牛血清(蘭州民海生物),DMEM(Gibco公司)。NFκB p65抗體(碧雲天生物技術研究所),羊抗兔IgG(中杉公司),FITC antirabbit IgG(Santa Cruze公司)。阿司匹林(Sigma公司)。酶標儀爲BioRad 公司產品。

    1.2  細胞培養 

    人胃癌細胞株SGC7901用含10%小牛血清的DMEM培養,置於37℃,5% CO2的孵育箱中培養。待細胞鋪滿瓶底後,用0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA的混合消化液消化成單細胞,傳代培養,取對數生長期的細胞進行實驗。

    1.3  MTT實驗 

    取對數生長期的SGC7901細胞,用上述消化液消化後製成單細胞懸液,記數,調整細胞密度爲4×104/ml,接種於96孔培養板上,每孔200 μl(每孔8 000個),取不含細胞的培養液作空白調零。細胞繼續培養24 h後,各孔分別加入終濃度爲0.1,1,5,10 mmol/L的阿司匹林,以不含阿司匹林的培養液作爲陰性對照,各組設3個復孔。分別培養24,48,72 h後,各孔加入0.5%的MTT 20 μl,繼續培養4 h,吸除孔內液體,各孔加入150 μl DMSO,震盪10 min後,用酶標儀在570 nm波長處測光密度(D)值,並計算阿司匹林對SGC7901細胞的抑制率,抑制率=(1-實驗組D均值/對照組D均值)×100%。該實驗重複3次。

    1.4  DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測細胞凋亡

    1.4.1  DNA提取  取對數生長期的SGC7901細胞接種於6孔板內,以終濃度爲10 mmol/L的阿司匹林分別作用6,12,24 h;收集細胞至EP管中,加入DNA提取緩衝液進行提取,將最終收集的DNA沉澱溶於適量滅菌水中。

    1.4.2  電泳  取5 μl DNA樣品,加入0.5 μl上樣緩衝液,混勻後用1%的瓊脂糖凝膠在100 V,10 mA條件下電泳1 h。在紫外燈下進行觀察。

    1.5  蛋白質印跡法檢測NFκB p65的表達

    1.5.1  核蛋白的提取  細胞接種和處理同“1.4”。用預冷的PBS洗2次,將細胞刮下移至EP管中,4℃離心5 min收集細胞。各EP管中細胞經緩衝液A,PMSF,緩衝液B作用後提取到核蛋白。將蛋白樣品與2×上樣緩衝液混勻,煮沸5 min,-20℃保存備用。

    1.5.2  蛋白質印跡  10%的SDSPAGE,各泳道上樣量爲8 μl,先80 V電泳20 min,然後以100 V電泳1.5 h分離蛋白樣品。

    1.5.3  電轉膜  4℃,90 mA恆流轉膜過夜。轉好後取出PVDF膜,在5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h。

    1.5.4  與抗體反應  將膜與1∶500稀釋的NFκB p65抗體4℃孵育過夜,用TBST漂洗3次,每次5 min。加入HRP標記的羊抗兔IgG(1∶5 000稀釋),室溫下孵育1 h,TBST洗3次,每次5 min。用ECL發光劑顯示陽性條帶,在Typhoon分子成像系統上掃描結果,用軟件測得NFκB p65和GAPDH條帶的灰度值,將兩者的比值作爲半定量結果(相對值),作出直方圖。並進行統計學分析。

    1.6  免疫熒光法檢測NFκB p65的表達 

    將SGC7901細胞接種在置於24孔細胞培養板中的蓋玻片上,密度爲30%左右,培養24 h後加入不同終濃度的阿司匹林,繼續培養24 h。細胞用新配的4%低聚甲醛固定4℃過夜,PBS洗3遍;用0.3%的TritonX100作用8 min以使細胞膜通透性增加;加3%BSA室溫孵育1 h以封閉非特異結合位點;與1∶500稀釋的NFκB p65抗體4℃孵育過夜;加入FITC標記的二抗,室溫孵育1 h。以上每步操作後均用PBS洗3遍。用甘油封片後於熒光顯微鏡下觀察結果。

    1.7  統計分析 

    實驗數據以均數±標準差(±s)表示,用SPSS11.5軟件對數據進行處理,採用單因素方差分析,以α=0.05爲檢驗水準。

    2  結  果

    2.1  阿司匹林對SGC7901細胞株增殖的影響

    表1結果所示爲SGC7901細胞株經阿司匹林作用後測得的光密度值,在同一時間組,隨着阿司匹林作用濃度增加,測得的光密度值逐漸減小。由圖1可見,在同一阿司匹林濃度作用組,隨着阿司匹林作用時間的延長,其對SGC7901細胞株增殖的抑制率逐漸增加;在阿司匹林作用時間相同的情況下,其對SGC7901細胞株增殖的抑制率隨作用濃度增加而增加,具有明顯的量效和時效關係(P<0.05,P<0.01)。表1  SGC7901細胞經阿司匹林作用後的D值變化

    2.2  DNA瓊脂糖凝膠電泳結果

    DNA凝膠電泳圖譜呈現“梯子狀”斷裂現象是細胞凋亡的一個重要標誌。SGC7901細胞經10 mmol/L的阿司匹林作用6 h和12 h後,出現了DNA ladder,說明阿司匹林作用6 h和12 h後誘導細胞凋亡,隨着作用時間延長到24 h則成“塗片”狀,說明出現了細胞壞死現象。見圖2。

    2.3  阿司匹林對SGC7901細胞NFκB p65表達的影響

    不同濃度阿司匹林與SGC7901細胞作用24 h,以及10 mmol/L的阿司匹林與SGC7901作用不同時間後,分別提取核蛋白,通過蛋白質印跡法檢測NFκB p65在覈內的表達情況。圖3,圖4結果顯示,阿司匹林能降低NFκB p65在覈內的表達,且隨着阿司匹林作用濃度的增加和作用時間的延長,其表達明顯降低(P<0.05, P<0.01)。

    2.4  免疫熒光法檢測NFκB p65的表達

    圖5免疫熒光檢測結果顯示,SGC7901細胞的胞核可見綠色熒光,隨着阿司匹林濃度的增加和作用時間的延長,熒光強度逐漸減弱,在10 mmol/L的阿司匹林作用組,基本看不到熒光。圖6結果顯示,隨着阿司匹林作用時間的延長,熒光強度逐漸減弱。10 mmol/L阿司匹林作用達24 h時,NFκB p65在覈內的表達已非常低。

    3  討  論

    阿司匹林是廣泛使用的非甾體類抗炎藥,研究表明[5],長期服用阿司匹林的人羣結腸癌的發病率較普通人羣明顯降低。流行病學研究也顯示,阿司匹林可減少胃癌發生的危險,並延長胃癌患者的存活期。我們通過MTT實驗證實,阿司匹林對胃癌細胞SGC7901增殖有明顯的抑制作用,其抑制率隨着阿司匹林作用濃度的增加和作用時間的延長而增加,具有較好的量效和時效關係。本次實驗還發現,阿司匹林能降低SGC7901細胞NFκB p65的表達,進而抑制胃癌細胞的增殖。

    阿司匹林抑制胃腸道腫瘤的作用機制尚不十分明確。過去大量研究顯示,阿司匹林能抑制COX2活性,下調COX2的表達,通過抑制COX2自身作用或抑制PGE2的合成而發揮抗腫瘤效應。目前,信號傳導通路成爲阿司匹林抑瘤機制中的研究熱點。NFκB信號通路便是其中之一。NFκB是由多肽鏈p50和p65兩個亞基組成的同源或異源二聚體,其中主要發揮生理作用的是p50p65異源二聚體。NFκB在炎症、細胞增殖和凋亡中是一種關鍵性的轉錄調節因子[6]。NFκB在胞質中以兩種無活性的形式存在,在受到TNF等刺激時,NFκB與抑制分子IκB解離,導致IκB 的磷酸化和泛素化繼而被降解,p50p65二聚體發生核轉位而發揮基因調控作用,其活化通常與細胞凋亡有關[7],通過激活抗凋亡基因和其他靶基因而發揮抗凋亡作用。研究證實,NFκB在腫瘤組織中呈異常活性表達[8]。本實驗表明,阿司匹林能抑制SGC7901細胞NFκB活化,降低細胞核內NFκB p65表達,從而拮抗NFκB的抗凋亡作用。其機制可能通過與IκB激酶β(IKKβ)特異性結合,阻止IκB磷酸化和降解,從而抑制NFκB p65活化;也可能直接通過抑制NFκB p65核轉位,而與IKKβ活性和IκB 基因轉錄無關。此外,阿司匹林誘導胃癌細胞凋亡是其抗腫瘤效應的一個非常重要的機制, 很多研究都表明阿司匹林有抑制胃癌細胞生長, 促進胃癌細胞凋亡的作用。本實驗通過DNA瓊脂糖凝膠電泳顯示,SGC7901細胞經10 mmol/L阿司匹林作用不同時間後,在6 h    和12 h時可見凋亡條帶,提示促進腫瘤細胞凋亡爲阿司匹林抑制SGC7901細胞增殖的機制之一。

    鑑於阿司匹林對胃癌細胞具有抑制作用,並能延長胃癌患者的生存期,臨牀可將其作爲預防性用藥以降低胃癌的發病率,也可將其用於早期胃癌患者以降低病死率。目前,阿司匹林經COX2途徑抑制胃癌細胞增殖研究的較爲清楚,而有關信號傳導方面的機制尚不十分明確。通過本次實驗我們還可推測阿司匹林還可能通過凋亡以外的途徑對腫瘤細胞增殖產生抑制作用,這將在以後進一步深入研究。針對阿司匹林對胃癌發生的信號傳導途徑具有抑制作用,我們可爲胃癌的治療確定一些新的靶位,爲胃癌的藥物治療和基因治療提供新的手段。

【參考文獻】
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