【摘要】 目的： 研究RNA干擾切除修復交叉互補基因1(ERCC1)的表達後，卵巢癌細胞A2780對順鉑耐藥性的變
化。方法： A2780細胞分別轉染ERCC1基因的siRNA和GFPsiRNA，並給予順鉑(使其終濃度達到3 μmol/L)，蛋白質印跡法分別檢測順鉑給藥前後ERCC1蛋白的表達，並用MTT法檢測順鉑不同濃度下A2780細胞的存活率。結果： ①轉染ERCC1 siRNA後，實驗組蛋白質表達量較對照組顯著降低;②ERCC1 siRNA+順鉑組的ERCC1蛋白表達要弱於ERCC1 siRNA+PBS組，而GFP siRNA+順鉑組的蛋白表達要弱於GFP siRNA+PBS組;③順鉑(濃度在0.75～12 μmol/L之間)呈濃度依賴性地降低A2780細胞的存活率;④在相同濃度順鉑的作用下，與GFPsiRNA組相比，ERCC1siRNA組的順鉑量效曲線左移。結論： 順鉑能抑制沉默ERCC1基因後A2780細胞的生長，且在一定濃度範圍內呈濃度依賴性;ERCC1是參與順鉑耐藥性產生的重要因素之一。
【關鍵詞】 RNA干擾; 切除修復交叉互補基因1; 順鉑; 耐藥性; 卵巢癌
Impacts of ERCC1 silencing on Cisplatin resistance in ovarian cancer cell
SUN Yehong, CHEN Fuqiang, ZHU Ying, LI Tiyuan
(Center of Clinical Research,Shenzhen People′s Hospital, Shenzhen Guangdong 518020, China)
[Abstract] Objective: To investigate the influence of RNA interfering the expression of excision repair crosscomplementing 1(ERCC1) gene on the sensitivity of ovarian cancer cell A2780 to Cisplatin.Methods： SiRNA
and GFP siRNA was transfected to knock out ERCC1 gene instantaneous and make a control manner respectively. Cisplatin(final concentration of 3μmol/L) was given to the knockouted cells. Western blot was taken for the analyses of ERCC1 protein expression in A2780 cells before and after Cisplatin was given. Methyl thiazolyl tetrazolium(MTT)colorimetric assay were used to determine the livability of the cancer cells in different Cisplatin concentration. Results： ①After transfection of ERCC1 siRNA,The results showed the ERCC1 protein expression level of control group was significantly higher than that of experimental group; ②ERCC1 siRNA+Cisplatin group and GFP siRNA+Cisplatin group expressed less ERCC1 protein than ERCC1 siRNA+PBS group and GFP siRNA+PBS group respectively;③Cisplatin(at the concentration of 0.75～12μmol/L)inhibited the livability of A2780 cells in a dosedependent manner in despite of siRNA; ④At a same concentration of Cisplatin, the doseeffect curve of knockout group was left to that of control group. Conclusion： Cisplatin inhibited the proliferation of A2780 cells in a dosedependent manner in despite of siRNA; ERCC1 is one of the important reasons of Cisplatin resistance in A2780 cell.
[Key words] RNA interference; excision repair crosscomplementing 1 gene; Cisplatin resistance; ovarian cancer
順鉑[cisDiamminedichloroplatinum(Ⅱ)，Cisplatin，CDDP]是卵巢癌等癌症治療中使用最爲廣泛的化療藥物之一。順鉑通過使腫瘤細胞形成DNA加合物，造成腫瘤細胞的DNA損傷，繼而使腫瘤細胞DNA的複製被抑制，細胞分裂再生停止，最終殺滅腫瘤細胞。然而，順鉑的療效會因癌細胞內在或者後天(藥物誘導)獲得的耐藥性而減弱。到目前爲止，對順鉑的體內耐藥機制並不完全清楚，但是其中核苷酸切除修復(nucleotide excision repair，NER)途徑對鉑類藥物形成的DNA加合物的切割修復在腫瘤對鉑類藥物的耐藥過程中起着非常重要的作用[1]。
NER修復路徑有多種因子參與，切除修復交叉互補蛋白1(excision repair crosscomplementing protein 1，ERCC1)在其中起着決定性作用[2-4]。ERCC1對DNA損傷的識別功能、ERCC1的酶切割活力對腫瘤細胞的DNA損傷修復能力和鉑類藥物耐藥都具有重要影響[5]。本研究應用RNA干擾(siRNA)技術沉默ERCC1基因，探討在順鉑作用下，卵巢癌細胞株A2780 ERCC1基因表達的變化，以建立一個ERCC1缺損細胞模型，爲進一步研究ERCC1在腫瘤耐藥中的作用機制奠定基礎;同時探討沉默ERCC1基因後，順鉑對卵巢癌細胞株A2780細胞的損傷作用。
1 材料與方法
1.1 材 料
人卵巢癌細胞株A2780購自中國典型培養物保藏中心。RMPI 1640液體培養基購自Hyclone公司，OptiMEMⅠ無血清培養基、脂質體轉染試劑LipofectamineTM 2000購自Invitrogen 公司，胎牛血清購自奧地利PAA公司，ERCC1 siRNA168(siRNA)由Invitrogen 公司合成，GFP siRNA爲香港理工大學馬克威博士惠贈，兔抗人ERCC1抗體(貨號sc10785)爲Santa Cruz公司產品，鼠源抗α微管蛋白單抗(T9026)、順鉑購自美國Sigma公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒購自Beyotime公司。其他試劑均爲進口分裝或國產分析純。
1.2 方 法
1.2.1 A2780細胞培養 A2780細胞採用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基(內含100 U/ml青黴素，100 μg/ml鏈黴素)，在37°C，5%CO2的恆溫孵箱中培養。
1.2.2 轉染siRNA 針對ERCC1基因的siRNA通過Invitrogen網站設計，並由Invitrogen公司合成。序列(5′→ 3′)：(RNA)AUCGGAAUAAGGGCUUGGCTT。將稀釋的siRNA與稀釋的Lipofectamine 2000混合，室溫下孵育15 min，形成siRNA脂質體複合物。吸去A2780細胞培養基，用PBS洗一遍，每孔加入650 μl的無血清OptiMEM，加入150 μl上述複合物，在 37℃，含5%CO2的恆溫孵箱中培養4 h。然後加入含30%FBS的OptiMEM 400 μl培養16 h以上。對照組中則使用GFPsiRNA。
1.2.3 蛋白質印跡分析 在細胞轉染24 h後收集6孔板中的細胞，-20℃保存備用。BCA法測定蛋白的濃度，酶標儀測定570 nm處的D值，根據量效曲線計算出樣品的蛋白濃度。取出-20℃凍存蛋白裂解液100 μl與 6×加載緩衝液20 μl混合，進行十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)，轉膜，封閉後，將膜和一抗(ERCC1抗體，1∶500稀釋)一起孵育4℃過夜，TBST洗膜，加二抗(1∶1 000)，室溫孵育1 h，二氨基聯苯胺(DAB)顯色，於相對分子質量爲33 000處觀察ERCC1蛋白的表達條帶。以α微管蛋白作內參，圖片以Bandscan軟件分析條帶光密度。
1.2.4 順鉑對沉默ERCC1基因後A2780細胞ERCC1蛋白表達的影響 轉染siRNA 6 h後，給予順鉑(使其終濃度爲3 μmol/L)。18 h後以蛋白質印跡法檢測ERCC1的蛋白表達。步驟同“1.2.3”。本實驗設兩個實驗組：①ERCC1 siRNA+順鉑組，②GFP siRNA+順鉑組。每個實驗組相應的對照組爲①ERCC1 siRNA+PBS組，②GFP siRNA+PBS組。
1.2.5 順鉑致A2780細胞損傷實驗(MTT法測定細胞存活率) 順鉑用不含Mg2+的PBS配製成0.1%的母液，再稀釋至所需濃度。根據前期實驗研究，順鉑對於A2780的半數有效抑制濃度IC50爲0.75 μmol/L。本實驗共設置5個濃度：0.75，1.5，3，6和12 μmol/L。MTT檢測隨機分成3個實驗組：①ERCC1 siRNA+ 順鉑組(轉染ERCC1 siRNA，分別給予不同濃度的順鉑);②GFP siRNA+順鉑組(轉染GFP siRNA，分別給予不同濃度的順鉑);③空白+順鉑組(未加轉染試劑，分別給予不同濃度的順鉑);相應的3個對照組爲：①ERCC1 siRNA+PBS組(轉染ERCC1siRNA，給予PBS);②GFP siRNA+PBS組;③空白+PBS組。
細胞接種於96孔板上培養24 h後更換含10%FBS的RMPI 1640培養基，如“1.2.2”方法轉染siRNA，24 h後更換培養基，再向培養液中加入不同濃度的順鉑，對照組加入相同體積的PBS，各組均設3個復孔。 給藥24 h後，每孔加入5 mg/ml的MTT溶液20 μl，繼續孵育4 h後終止培養，吸棄培養上清液，每孔加入150 μl DMSO，恆溫振盪器上振盪10 min，酶聯免疫檢測儀570 nm波長處測定各孔光密度值，記錄結果。
細胞存活率=實驗組D值對照組D值×100%
1.2.6 數據統計 數據用±s表示，資料採用Oneway ANOVA結合NewmanKeuls檢驗分析各組間差異。P<0.05爲有統計學意義。
2 結 果
2.1 蛋白濃度測定
在波長570 nm處測定各個標準液的光密度，繪製標準曲線，獲得量效關係曲線公式並計算出樣品的濃度值，以保證蛋白上樣量的一致性。
2.2 A2780細胞ERCC1基因沉默效率鑑定
圖1內參α微管蛋白的蛋白質印跡結果顯示，與標準參照物相比，在第2，3泳道的相應位置都出現了大約55 000大小的條帶，其位置與預期的條帶符合。經Bandscan軟件分析，A，B兩個條帶的灰度無明顯差異。圖1中ERCC1結果顯示，A，B兩個泳道都在相同位置(約35 000)處出現特異性條帶(ERCC1)。A帶(ERCC1 siRNA組)是B帶(GFP siRNA組)亮度的75.31%。
2.3 沉默ERCC1基因後A2780細胞ERCC1蛋白表達的變化
圖2中內參α微管蛋白的蛋白質印跡結果顯示，與標準參照物條帶相比，在A，B，C，D的相應位 置都出現了大約55 000大小的條帶，其位置與預期的條帶符合，且A，B，C，D 4個條帶的灰度無明顯差異。圖2中ERCC1結果顯示，B，C，D亮度分別爲A的55.32%，65.97%，97.63%，這表明實驗組與對照組相比較，兩實驗(順鉑)組的ERCC1蛋白表達均要弱於對照(PBS)組;兩實驗組間比較，ERCC1 siRNA+順鉑組的ERCC1蛋白表達弱於GFP siRNA+順鉑組。
2.4 順鉑降低A2780細胞存活率
MTT法測定細胞活力結果發現，順鉑(0.75～12 μmol/L)呈濃度依賴性地降低A2780細胞存活率。順鉑在0.75 μmol/L時，轉染ERCC1 siRNA，GFP siRNA，空白3個實驗組中的細胞存活率分別爲相應對照組(給予PBS)的80.94%，86.53%和90.38%(P<0.05，差異有統計學意義)。隨着順鉑濃度的增高，細胞的死亡率增加，當順鉑濃度增加至12 μmol/L時，3個實驗組中的細胞存活率分別降至相應對照組的46.27%，53.79%和44.16%(P<0.01，差異有統計學意義)。結果均說明順鉑具有抑制A2780細胞生長的作用，且在一定的濃度範圍內呈濃度依賴性。見圖3。
2.5 沉默ERCC1基因增強順鉑致A2780 細胞損傷的作用
如圖4所示，在順鉑同一濃度，與GFP siRNA組相比，ERCC1 siRNA組的量效曲線左移，說明順鉑抑制細胞生長的作用，基因沉默組要強於未沉默組;而與GFP siRNA組相比，空白組的量效曲線右移。當順鉑濃度爲3，6或12 μmol/L時，與ERCC1 siRNA組相比，GFP siRNA組細胞存活率分別增加11.62%，14.41%和7.33%(P<0.05，有統計學意義)。這說明，轉染ERCC1基因的siRNA後，細胞對於CDPP的耐受功能明顯降低，ERCC1基因的沉默導致A2780細胞對CDPP更爲敏感。
3 討 論
核苷酸切除修復是DNA修復機制中的一條重要途徑。它主要修復累積性損傷，涉及DNA雙螺旋結構受損、紫外線導致的嘧啶二聚體、大分子致癌物導致的DNA加合物等DNA 鏈上較大損傷。NER的機制較爲複雜，涉及許多功能蛋白的相互作用[6，7]。其修復方式有兩種[8]：①轉錄耦聯修復(transcriptioncoupled NER,TCR);②全基因組修復(global genome NER，GGR)。與NER相關的基因有8種，其中ERCC1研究得最多。ERCC1基因位於染色體19q13.2～19q13.3，全長15 kb，含10個外顯子,編碼含297個氨基酸的蛋白質，相對分子質量爲32 500[9]。
關於卵巢癌鉑類耐藥與ERCC1 相關性的研究較多。Dabholkar等[10]的研究表明，接受過順鉑化療的晚期卵巢癌患者腫瘤組織中ERCC1，XPB，XPA，CSB 均表達增高，而僅ERCC1 mRNA 表達與順鉑化療療效之間存在顯著相關性。對42例經順鉑化療的卵巢癌患者的研究發現,化療耐藥組ERCC1基因的陽性表達率明顯高於化療敏感組,前者爲77.3%,而後者爲35.0%,表明ERCC1表達的增高與順鉑耐藥相關[11]。在卵巢上皮癌組織中, ERCC1表達存在腫瘤異質性。在週期性化療中,順鉑化療主要殺傷ERCC1陰性表達的腫瘤細胞,而ERCC1陽性表達的腫瘤細胞則對順鉑不敏感[11]。
本研究表明，隨着順鉑用藥劑量的增加，細胞的死亡增多，說明在一定濃度範圍內，順鉑抑制ERCC1基因沉默和未沉默ERCC1基因的A2780細胞生長的作用均呈劑量依賴型;沉默卵巢癌細胞系A2780的ERCC1基因後，ERCC1的損傷修復功能明顯受損，細胞對鉑類藥物的敏感度上升，耐藥性降低，進一步說明ERCC1是參與順鉑耐藥性產生的重要因素之一。至於與GFP siRNA組相比，空白組的量效曲線右移，這是因爲轉染試劑本身的輕微毒性作用所致。轉染ERCC1 siRNA後，細胞對於藥物的耐受功能明顯降低，這一方面佐證了ERCC1基因在腫瘤細胞耐藥中的重要作用，另一方面也提示ERCC1 siRNA的沉默效果明顯。因此本方法是簡便易行的瞬時ERCC1基因剔除法，可進一步應用於ERCC1基因功能的深入研究。
ERCC1 可能成爲卵巢癌潛在的基因治療靶點。臨牀前期實驗證明，順鉑可以提高ERCC1的表達從而產生耐藥。那麼相反,變異的ERCC1表達可以增加順鉑的敏感性[5]。因此下一步工作將深入研究ERCC1基因變異對其功能的影響，探討外顯子在腫瘤耐藥中的作用及其可能機制。
【參考文獻】
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