【摘要】 目的： 通過胸腔移植的方法建立晚期肺癌的動物模型。方法： 經C57BL/6小鼠的腋後線第6肋間胸腔(胸腔模型組)或小鼠腋部皮下(皮下模型組)分別移植鼠源性Lewis肺癌細胞0.2ml （5×106ml-1），觀察小鼠的生存時間、小鼠體重、飼料消耗量、游泳試驗、常壓耐缺氧試驗，大體觀察胸腔、縱隔、胸水等肺癌細胞浸
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潤和轉移情況。結果： 胸腔模型組小鼠中位數生存時間13.5（8～18）d，皮下模型組小鼠中位數生存時間45（25～71）d，胸腔模型組的生存期範圍離散程度較皮下模型組小（Ｐ<0.05）。病程中胸腔模型組小鼠體重下降、攝食減少等惡病質體徵較皮下模型組明顯（Ｐ<0.01），胸腔模型組小鼠活動減少、睡眠時間縮短、蜷曲、毛髮脫落等現象較皮下模型組多見，胸腔模型組小鼠游泳實驗及耐缺氧實驗時間較皮下模型組明顯縮短（Ｐ<0.01），胸腔模型組小鼠早期可出現胸水和腫瘤轉移，而皮下模型組小鼠早期未見胸水和腫瘤轉移。結論： 胸腔移植模型可作爲晚期肺癌動物模型。
【關鍵詞】 Lewis肺癌 胸腔移植模型 皮下移植模型 晚期肺癌 小鼠
肺癌動物模型與臨牀結果一直存在差距，尤以晚期模型更爲明顯。我們在進行動物實驗研究中發現，目前使用的腫瘤皮下移植模型中，動物生存時間差異很大，不利於生存期觀察。腫瘤發展到晚期也可以出現轉移，但是發生率很不一致。另外，模型的腫瘤負荷和產生的症狀、併發症、生存狀態也很不一致。爲了克服皮下移植模型缺陷，有學者採用將人類癌組織或腫瘤細胞懸液直接植入支氣管的方法，可以很好模擬支氣管肺癌的臨牀特徵，但是其技術要求較高，成功率較低［12］。另外，也有人採用外科手術移植方法，同樣也是成功率低於10%［3］。這些模型都需要無胸腺裸鼠或SCID小鼠，飼養條件高，實驗費用昂貴。鑑於肺癌模型的建立現狀，至今未見有經胸腔直接移植建立晚期肺癌模型的報道，因此，作者採用清潔級小鼠C57BL/6胸腔種植鼠源性Lewis肺癌細胞的方法，進一步比較該模型和皮下移植模型腫瘤生長狀況，觀察治療前後小鼠生存時間、生存狀態及其相互關係，研究該模型穩定性和實用性。
1 材料與方法
1.1 細胞株
鼠源性Lewis肺癌細胞系由中國科學院上海細胞庫提供，在含10%胎牛血清及雙抗（青黴素100IU·ml-1，鏈黴素100IU·ml-1）的DMEM (GIBCO 公司產品) 完全培養液中培養，條件是37℃、5%CO2，2～3d更換1次培養液。細胞總數達到要求時用2.5%胰酶消化。消化前2h新鮮培養液換液1次，消化後再用新鮮培養液洗1次，臺盼藍拒染法測定活細胞數大於95％，調節細胞濃度爲5×106ml-1 細胞懸液備用。
1.2 動物
有C57BL/6遺傳背景的小鼠由徐州醫學院實驗動物中心提供並飼養於SPF級環境，室溫(25±2)℃，給予無菌全價營養顆粒飼料及無菌水。本研究選用的小鼠爲6～8周齡的雄鼠200只， 體重平均(18±1) g。
1.3 方法
200只小鼠隨機分爲胸腔模型組和皮下模型組，每組100只，將製作好的Ｌewis肺癌單細胞懸液，在每隻小鼠腋後線第6肋間胸腔或腋部皮下接種0.2ml（5×106 ml-1）。
1.4 生存指標檢測
1.4.1 生存期 造模至小鼠死亡的時間。
1.4.2 體重 在每日20:00～21:00時用電子稱測量每隻小鼠的體重，精確到1/100g，資料存入EXCEL備檢驗。
1.4.3 飼料消耗量 在每日20:00～21:00時定量給予小鼠飼餵無菌全價營養顆粒飼料，24h測量盒內剩餘的飼料量，計算小鼠的飼料消耗量，精確到1/100g。
飼料攝取量=前日飼料重量－次日測得飼料重量。
1.4.4 小鼠游泳實驗 在每組造模後第14天，令各組動物在水溫(17±1)℃下游泳，用相當於小鼠體重10%的橡皮泥在每隻小鼠尾部負重，分別放入玻璃缸內游泳並計時，注意觀察當小鼠頭部沉入水中10s不能浮出水面者即爲體力耗竭，即刻計時，爲小鼠游泳時間，比較各組小鼠因游泳致疲勞而死亡的時間。
1.4.5 小鼠常壓耐缺氧實驗 每組造模後第14天，各組的小鼠分別放入裝有25g鈉石灰的容積爲250ml的廣口瓶內（每瓶置放1只小鼠），用凡士林塗抹瓶口，使之不漏氣，立即計時，以呼吸停止爲指標，觀察小鼠因缺氧而死亡的時間，比較各組常壓下的耐缺氧時間。
1.4.6 大體觀察 觀察胸腔模型組小鼠胸腔、縱隔、心包、胸水等肺癌細胞浸潤和轉移情況。
1.5 數據處理
用SPSS 11.5軟件包處理，數據以x±s表示，組內差異采用方差分析（ANOVA），組間差異采用t檢驗，生存期取中位數並繪製生存曲線，Ｐ<0.05爲統計學差異有顯著性。
2 結 果
2.1 小鼠生存期觀察
胸腔模型組中位數生存時間13.5（8～18）d，皮下模型組中位數生存時間45（25～71）d。胸腔模型組的生存期範圍離散程度較皮下模型組小（Ｐ<0.05）。
2.2 小鼠生存狀態觀察
胸腔模型組小鼠體重下降、攝食減少等惡病質狀態較皮下模型組明顯，病程中胸腔模型組小鼠活動減少、睡眠時間縮短、蜷曲、毛髮脫落等症狀較皮下模型組多見（圖1、2）。
2.2.1 體重 平均體重胸腔模型組小鼠爲（12.19±4.69）g，皮下模型組小鼠爲（19.40±1.10）g，胸腔模型組較相應皮下模型組體重下降明顯（Ｐ<0.01）。
2.2.2 飼料消耗 飼料平均消耗量胸腔模型組小鼠爲（1.67±1.01）g，皮下模型組爲(3.16±0.11) g，胸腔模型組與相應皮下模型組相比下降明顯（Ｐ<0.01）。
2.2.3 耐缺氧實驗及游泳實驗 平均游泳時間胸腔模型組爲(12.67±3.27) s，皮下模型組爲(80.33±9.56) s，兩組比較差異有統計學意義(Ｐ<0.001)。平均耐缺氧時間胸腔模型組爲(42.50±5.61)min，皮下模型組爲(96.50±23.57)min，兩組比較差異有統計學意義（Ｐ<0.005）。
2.2.4 大體觀察 胸腔模型組小鼠出現胸水和腫瘤轉移，如縱隔、心包和肝轉移等（圖3～6）。皮下模型組未見腫瘤轉移。
3 討 論
小鼠的肺腫瘤在組織發生、臨牀過程和組織形態學上都與人類肺癌有相似之處。特別是應用近交系小鼠，便於實驗設計，使動物實驗結果準確、均一、經濟、重複性強，但直到目前，仍沒有令人滿意的能充分代表晚期肺癌臨牀生物學特徵的動物肺癌模型出現。
目前常用的小鼠肺癌動物模型有：（1）將肺癌細胞接種於裸鼠或其他免疫缺陷小鼠的皮下。此方法簡單易行，但皮下生長的肺癌與臨牀在肺部生長的肺癌生物學特性有很大不同，所以，應用此模型得到的實驗結果與臨牀應用的實際效果之間常有比較大的差異。（2）將小鼠的氣管分離，經過反覆凍融處理，然後將肺癌細胞接種到氣管，結紮氣管兩端後，再將氣管移植到重度複合免疫缺陷小鼠的皮下［4］。此方法雖然將肺癌細胞接種到氣管組織內，但方法較複雜，且需要將離體的氣管移植到其他小鼠皮下，肺癌細胞生長的生物特性也會改變。（3）切開胸壁皮膚， 將肺癌細胞或肺癌組織直接種植到肺內［56］。此方法有一定的創傷性和死亡率，肺癌細胞生長在肺實質內，但只能使70%～90%的接種小鼠產生腫瘤，對進行進一步的肺癌研究造成一定的影響。（4）將肺癌細胞直接注入重度複合免疫缺陷型小鼠的氣管以建立細支氣管內的肺癌模型［7］，此方法也未能建立理想的肺癌模型，究其原因可能是由於氣道假復層柱狀纖毛上皮的作用，將注入的細胞排出體外，一部分細胞可通過移植孔在氣管前形成腫瘤竈，使肺癌細胞難以在細支氣管內停留，也難以進入肺泡，故難以在肺臟內生長。
鑑於至今未見有經胸腔直接移植建立晚期肺癌模型的現狀，我們嘗試將Lewis 肺癌細胞接種於清潔級C57BL/6近交系小鼠胸腔及皮下製備肺癌腫瘤模型，系統地研究了小鼠存活時間、生存狀態。對肺癌模型進行可行性和實用性研究，爲晚期肺癌的研究探尋較理想的實驗工具。
實驗結果表明，胸腔模型組中位數生存時間13.5d，皮下模型組中位數生存時間45d。胸腔模型組的生存期範圍離散程度較皮下模型組小，較小的離散範圍使我們便於觀察，保證了模型的均一性，減少了實驗誤差。胸腔模型組小鼠體重下降、攝食減少等惡病質狀態較皮下模型組嚴重，病程中胸腔模型組小鼠活動減少、睡眠減少、蜷曲、毛髮脫落等症狀較皮下模型組多見。胸腔模型各組病程中體重和攝食下降較對應皮下模型組明顯，游泳及耐缺氧實驗時間較對應皮下模型組明顯縮短，而皮下模型組內小鼠各項生活狀態檢測指標變化不明顯。另外，胸腔模型組小鼠可出現腫瘤轉移，而皮下模型組很少有轉移的情況。從以上結果可以看出，胸腔移植模型較皮下移植模型能更好模擬晚期肺癌的表現，這體現了胸腔移植模型的實用性和穩定性。因此從本研究我們得出如下結論：胸腔移植模型可作爲晚期肺癌的動物模型，可用來評價癌症治療效果，進行治療方案選擇，或者評價藥物的效果及副作用，並可用於抗癌藥物的篩選，這也是我們進一步研究的方向。
另外在造模中應注意以下幾點：（1）胸腔穿刺要輕、快，以免引起氣胸導致動物死亡；（2）胸腔穿刺要注意深度，以免刺破心臟、肺或大血管引起動物死亡；（3）本研究選用的是Lewis肺癌細胞株，而非瘤株，這是由於通過瘤株製備的瘤細胞懸液在研磨時會破壞腫瘤細胞的完整性，懸液中還存在許多結締組織，不僅可能堵塞移植針頭，而且還可能使細胞計數不準確，造成造模不均的問題。
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