作者：趙長宏,陸海波,馬玉彥 ,魯海玲,唐雅莉,李鑫 '
【摘要】 目的 應用SELDI蛋白質芯片檢測胃癌患者血清蛋白質指紋圖譜，篩選候選腫瘤標誌物以建立診斷模型，並探討其診斷早期胃癌的臨牀意義。方法 表面加強激光解吸電離飛行時間質譜（SELDITOFMS）技術及其配套蛋白質芯片檢測34例胃癌患者（Ⅰ/Ⅱ期12例與Ⅲ/Ⅳ期22例）和30例健康人的血清蛋白質組圖譜，運用判別分析處理數據篩選標誌物並建立診斷模型。結果 2 046m/z、3 179m/z、1 817m/z、1 725m/z和1 588m/z等5個蛋白質峯組合所構建的診斷模型能達到鑑別胃癌患者和健康人的最佳診斷效果，特異度94.1%（32/34）， 靈敏度93.3%（28/30）。單個4 665m/z蛋白質峯診斷模型可達到鑑別Ⅰ/Ⅱ期與Ⅲ/Ⅳ期胃癌效果，其特異度91.6%（11/12），靈敏度95.4%（21/22)。結論 該方法在胃癌的診斷尤其是早期診斷、術前分期及候選腫瘤標誌物篩選等方面具有一定價值，值得進一步研究。
【關鍵詞】 早期胃癌 SELDITOF 診斷；蛋白質組學
Detection and Evaluation of Serum Proteomic Patterns by SELDITOFMS in Early Gastric Cancer
Corresponding Author:LU Haibo,Email:lu_haibo200@126.comAbstract：Objective To detect the serum proteomic patterns using SELDITOFMS ProteinChip array technology in gastric cancer,screen biomarker candidates,build diagnostic models and evaluate its clinical significance in early gastric cancer.Methods SELDITOFMS ProteinChip was used to detect the serum proteomic patterns of 34 patients with gastric cancer （12 cases of Ⅰ/Ⅱstage and 22 cases of Ⅲ/Ⅳ stage） and 30 healthy people.The diagnostic models were developed and validated by discriminant analysis.Results The model composed by 5 protein peaks 2 046m/z、3 179m/z、1 817m/z、1 725m/z and 1 588m/z could do the best in the diagnosis of gastric cancer.The specificity and sensitivity of it were 94.1%（32/34）and 93.3%（28/30） respectively.The single peak 4 665m/z can distinguish stageⅠ/Ⅱstage and Ⅲ/Ⅳ gastric cancer,the specificity and sensitivity of it were 91.7%，(11/12) and 95.4%，(21/22).Conclusion This method show great potential for the early detection,staging before operation and screening novel and better biomarkers to early gastric cancer.
Key words：Early Gastric cancer; SELDITOF; Diagnosis; Proteomics
胃癌是常見惡性腫瘤之一，在世界範圍內爲第二多發惡性腫瘤，是消化系統最多發腫瘤[1，2]。可能是胃癌臨牀的異質性表現，迄今爲止胃癌尚缺乏理想的腫瘤標誌物，從而也給其早期診斷、術後療效評價、預後監測及胃癌患者的康復等造成了一定的困難。
表面加強激光解吸電離-飛行時間質譜（Surfaceenhanced laser desorption/ionization timeofflight mass spectrometry,SELDI-TOF-MS）是近年來發展起來的一種全新的蛋白質組學研究手段，其基本原理是通過特定的化學表面結合蛋白質分子再以激光轟擊，使蛋白質成爲離子而飛行於電場中並被檢測器所測得，進而用不同位置、強度的峯來表示各種不同的蛋白質及其相對含量，最終形成可用於分析的圖譜。該方法克服了傳統蛋白質組學研究方法所存在的諸多問題，實現了質譜技術用於臨牀檢測的飛躍[3，4]。
本研究應用SELDI質譜儀及其配套蛋白質芯片檢測了34例胃癌患者和30例健康人的血清蛋白質指紋圖譜，以篩選可用於臨牀胃癌早期診斷的特異性生物標記物。
1.1資料 2004年1月～8月間我院收治的初診胃癌患者34例，中位年齡52歲（34～74歲）。常規根治手術後按UICC 1997年胃癌 PTNM分期法進行分期，其中Ⅰ期患者6例，Ⅱ期6例，Ⅲ期5例， Ⅳ17例，診斷均經術後病理證實。健康人羣來自我院經胃鏡取材並經病理證實的無胃部疾病的30例，中位年齡49歲（25～72歲）。所有血樣均於清晨空腹採集，靜置離心分離血清，－80℃低溫冰箱保存。
1.2主要儀器、軟件及試劑 PBSⅡ表面加強激光解吸電離飛行時間質譜儀（SELDITOFMS）、能量吸收分子SPA、CM10型蛋白質芯片及相應分析軟件ProteinChip Software 3.2.1（美國Ciphergen公司）；HEPES緩衝鹽（Sigma公司）；CHAPS緩衝鹽（Sigma公司）。
1.3方法 CM10 芯片（弱陽離子+疏水膜）
1.3.1步驟 用HPLCH2O洗滌芯片，400r/min，震盪5min三次。先將10mM/L HCL倒入帶蓋試管中蓋好後。震盪5min。在用去離子水沖洗數次，再將芯片裝入HPLCH2O試管中震盪5min。將芯片架子，膠墊超聲清洗乾淨，用去離子水沖洗數次晾乾後，將芯片裝入處理器上。每孔加入200μl 0.1M NaAC 結合buffer,室溫振盪250r/min,5min重複一次。甩幹後再上樣品。
1.3.2樣品處理 ①血清樣品冰上溶解，4度離心10 000r/min，5min。取上清20μl加入30μl U9(含DTT)混勻，4度震盪250/min,20min,每孔用封口膜封好。②U1配法：100μl U9(含DTT)+900μl 50 mMHepes pH 7.0。③每孔加入100μl U1緩衝液混勻，蓋嚴振盪250r/min，30min。④從上述150μl 變形樣品中取出50μl,加入到200μl 0.1M NaAC 結合buffer 中混勻，取出100μl 上樣，室溫振盪250r/min,60min,取出樣品。⑤每孔加入150μl 0.1M NaAC buffer,室溫振盪250r/min,5min,倒掉後加入150μl NaACbuffer,共3次。再用1mM Hepes pH 4.0 淋洗芯片30s,重複一次。除去芯片晾乾。⑥將SPA高速離心30s,在SPA管中，加入200μl乙腈，200μl 1% TFA充分振盪5min，靜止5min。離心1 000r/min 1min。⑦每孔加入SPA 0.5～1.0μl/點，重複一次。兩次之間各點風乾。
1.3.3芯片檢測 用加有Allinone標準蛋白質的NP20芯片校正質譜儀，在Ciphergen ProteinChip軟件中設定讀片程序讀取芯片數據。計算機以每秒1×109Hz的速度獲得原始數據並快速精確地繪製出蛋白質質譜圖。其中縱座標爲蛋白質相對含量，橫座標爲蛋白質質荷比。
1.3.4蛋白質質荷比 結合SPA後的蛋白質在SELDITOFMS氦氖激光器的激光轟擊下電離，帶有電荷的蛋白質在加速電場的作用下，不同質荷比的蛋白質在長度一定的真空管中飛行所需的時間不同，蛋白質的質荷比（M/Z）與電離飛行時間的平方成正比。由E=UZ=1/2mv2；t=L/v推出M/Z=Kt2=(2U/L2)t2。其中Z爲離子所帶電荷數，U爲電壓，v爲飛行速度，L爲加速飛行電場電壓，K爲常數。
1.3.5蛋白質相對含量 帶有正電荷的蛋白質離子束在到達檢測器的一瞬間，電子倍增器將產生的瞬時電流（瞬時電流It=Q/t，其中Q爲t時刻檢測器檢測到的電荷數）轉換成蛋白質的相對含量。
1.4數據收集及統計學分析 質譜儀參數設定：激光強度190，靈敏度9，數據收集範圍1 500～20 000m/z（蛋白質質量和電荷比值，以下簡稱質荷比）。原始數據先以Proteinchip Software 3.2.1軟件校正，使總離子強度及分子量達到均一，並過濾噪音，初始噪音過濾值5，二次噪音過濾值2，以8%爲最小閾值進行聚類。經上述數據預處理後，比較胃癌患者與健康人血清蛋白質質譜數據（由Proteinchip Software 3.2.1自帶的Biomarker Wizard 5.0軟件完成），用數據樹方法對目標對象進行分類，對數據分組及相關性性進行分析。尋找兩組之間表達有差異的蛋白質峯，結合各個峯的權重比較不同蛋白質峯排列組合的判別分析結果，選出最佳排列組合，最後同時輸出原始判別和交叉驗證的結果。
2.1生物標記物的發現 用Biomarker Wizard軟件和Proteinchip Software軟件分析34例胃癌患者和30例健康人血清中蛋白質的組成，結果發現2 046m/z、3 179m/z、1 817m/z、1 725m/z和1 588m/z等5個蛋白質組成的生物標記物可將正常人與胃癌患者準確的分組。用這個生物標記物分析數據共產生7個終節點，見圖1：其中1、2、5、7均爲只包含胃癌患者，共34例，滿足≤1.475（M2046）、≤2.239(M3179)、≤1.321(M1817)(括號代表相應蛋白質相對含量，下同)爲終節點1，滿足≤ 1.475（M2046）、≤2.239(M3179)、>1.321（M1752）m/z、≤ -0.856（1817）爲終節點2，滿足≤1.475（M2046）、>2.239(M3179)、>1.798（M1929）爲終節點5，滿足>1.475（M2046）、>-0.697（M1817）爲終節點7；終節點3、4、6爲正常人，共30例，滿足≤1.475（M2046）、≤2.239(M3179)、>1.321（M1752）、>-0.856（1817）爲終節點3，滿足≤1.475（M2046）、>2.2397(M3179)、≤1.798（M1929）爲終節點4，滿足>1.475（M2046）、>-0.697（ M1817）爲終節點7。錯誤分組率爲1.67%。
2.2胃癌患者與健康人的比較 通過對34例胃癌患者和30例健康人血清蛋白質質譜數據的比較，判別分析顯示其中5個蛋白質峯組合所構建的診斷模型（模型Ⅰ）能達到最佳診斷效果：2 046m/z、3 179m/z、1 817m/z、1 725m/z和1 588m/z，其中質荷比爲2 046m/z的蛋白質峯如圖1所示，可見正常人質荷比爲2 046m/z的蛋白質含量明顯低於胃癌患者，經方差分析，差異有顯著性（P<0.05）。原始判別的準確率爲93.75%（60/64），特異度94.1%（32/34）， 靈敏度93.3%（28/30），見表1；交叉驗證的準確率爲76.56%（49/64），特異度73.5%（25/34）， 靈敏度80.0%（24/30），見表2。交叉驗證顯示模型Ⅰ對34例胃癌患者中的25例做出了準確預測。表1 模型Ⅰ原始判別的結果（
2.3Ⅰ/Ⅱ期與Ⅲ/Ⅳ期胃癌患者的比較 比較12例Ⅰ/Ⅱ期患者與22例Ⅲ/Ⅳ期患者的質譜數據，其中4 665m/z 的單個蛋白質峯的診斷模型（模型Ⅱ）可達到鑑別Ⅰ/Ⅱ期與Ⅲ/Ⅳ期患者的最佳效果。原始判別，總準確率94.1%（32/34），特異度91.7%（11/12）， 靈敏度95.4%（21/22）；交叉驗證結果，特異度91.7%（11/12），靈敏度86.4%（19/22），總準確率88.2%（30/34）。
胃癌的診斷手段正從症狀、臨牀體檢、胃鏡檢查等經典手段向基因診斷、分子生物學檢測手段發展[1，2]，但作爲後者重要組成部分之一的胃癌血清腫瘤標誌物，近年來發展較緩，不能滿足臨牀實際應用的需要。運用SELDITOFMS技術來分析鑑定腫瘤不同於非腫瘤的蛋白質表達譜的全貌，從而獲得內因、外因共同作用下腫瘤發生發展的較完整信息[5]，正是針對目前研究現狀的不足之處做出的有益嘗試，該方法已成功應用於卵巢癌以及前列腺癌[6,7]。在胃癌方面的研究也偶見報道[8,9]。
判別分析是一種根據觀察或測量到的若干變量值，來判斷研究對象如何分類的常用統計分析方法，是應用計算機進行疾病輔助診斷的主要統計學基礎。其基本原理是根據已知的分類（如屬於胃癌組或是屬於健康人組）和表明特徵的變量值（即各蛋白質峯的峯值數據）建立判別函數，再將某個個體的自變量值回代到判別函數，得出判別分數或計算屬於各類的概率，從而判斷該個體屬於哪一類。本研究過程中的判別分析主要分兩個步驟進行，即原始判別和交叉驗證。前者是將所有病例的峯值數據建立函數，再逐一將每個病例代入函數進行判別；後者則是利用除了某一病例外的其餘所有病例的數據建立函數，再把這一未參與函數構建的病例數據代入函數進行判別，如此判別每一個病例。這種交叉驗證的方法在統計學上稱爲“留一法”，與原始判別相比更爲真實、穩定、可靠，所以我們選擇了交叉驗證的結果作爲最終結果。
本研究運用SELDITOFMS蛋白質芯片技術，得出了胃癌患者不同於健康人的血清蛋白質指紋圖譜，應用判別分析篩選出能達到最佳診斷效果的蛋白質峯組合並建立診斷模型Ⅰ，交叉驗證結果較滿意，其靈敏度和特異度均遠高於現有的各種腫瘤標誌物，具有一定的診斷價值，篩選出的差異表達蛋白質將有可能成爲新的候選腫瘤標誌物。通過比較其對不同分期胃癌患者的診斷準確率可見，該模型對Ⅰ、Ⅱ期患者的診斷能力不亞於對Ⅲ、Ⅳ期的診斷，提示本方法在胃癌早期診斷方面有一定價值，所篩選出的候選腫瘤標誌物也將有可能用於早期檢測。而上文所提及的幾種現有標誌物，目前僅認爲其在胃癌復發和轉移的監測中有一定參考價值，而對早期診斷的價值則較低。比較Ⅰ/Ⅱ期患者和Ⅲ/Ⅳ期患者質譜數據構建的模型Ⅱ（單個蛋白質峯4 665m/z），能夠較爲準確的區分某一個胃癌患者是Ⅰ/Ⅱ期還是Ⅲ/Ⅳ期，有助於早期診斷、改善預後，同時對術前治療及手術方式的合理選擇也具有一定的參考價值。
需要指出的是，運用判別分析建立診斷模型的基本思路是選擇具有最佳診斷效力的蛋白質峯組合而不是評價單個蛋白質峯的診斷效力；所得到的最佳組合也並非診斷效力由高到低排列的各個峯的簡單疊加。因此，利用這一方法篩選候選腫瘤標誌物時，不能僅侷限於最佳診斷組合中所列出的幾個蛋白質，而應該着眼於所有表達差異具有統計學意義的蛋白質。
綜上所述，SELDITOFMS技術在胃癌的診斷尤其是早期診斷、候選腫瘤標誌物的篩選及術前分期等方面具有一定的價值。進一步的研究仍在進行中。
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